产品组成：

产品简介：

细胞凋亡是发生在胚胎发育和维持组织稳态过程中的正常生理过程，伴随着许多形态学特征改变，其中细胞膜的丢失是细胞凋亡早期的特征之一。在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(phosphotidylserine，PS)只分布在细胞膜磷脂双分子层的内侧，但在细胞凋亡早期，PS 会从脂膜的内侧翻转外侧，使其暴露于细胞外侧。Annexin V（膜联蛋白V）是一种 Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，对 PS具有高度亲和力，会与暴露 PS 的细胞特异性结合， 因此 Annexin V 被作为检测细胞早期凋亡的指标之一。由于凋亡晚期或坏死细胞膜丧失完整性，而7-氨基放线菌素D（7-Amino Actinomycin D, 7-AAD）可与双链DNA特异性结合并产生强烈的荧光，与Annexin V搭配使用，可区分处于不同凋亡时期的细胞。

本产品通过将 Annexin V用 APC进行标记后作为检测探针，检测细胞的早期凋亡。同时以7-AAD区分存活的细胞与坏死、晚期凋亡细胞。Annexin V-APC和7-AAD结合使用，活细胞呈现阴性染色（Annexin V-/7-AAD-），早期凋亡细胞呈现单荧光阳性（Annexin V+/7-AAD- ），而晚期凋亡细胞和坏死细胞呈现双荧光阳性（Annexin V+/7-AAD+）。

本试剂盒适用于流式细胞仪或荧光显微镜检测。

使用说明：
1、细胞收集

悬浮细胞：取细胞悬液，经500g，4℃离心5 min收集细胞；

贴壁细胞：先收集细胞培养上清液。然后用不含EDTA的胰酶消化后，与细胞培养上清液合并，经500g，4℃离心5 min 收集细胞。胰酶消化时间不宜过长，以免过度消化引起假阳性。

2、 用预冷的PBS清洗细胞 2 次，每次500g 、4℃离心5 min收集细胞；

3、 用预冷的1×Binding Buffer 轻柔重悬细胞，调整细胞浓度至 1~5x10⁶/mL；

4、 取100μL 细胞悬液，加入5 µL Annexin V-APC和5 µL 7-AAD，轻柔混匀，室温避光 8-10 min；

5、 加入400 µL 预冷的1x Binding Buffer，轻轻摇匀，1 h 内用流式细胞仪或者荧光显微镜进行检测。

6、结果分析

1. 流式细胞仪检测

       a. 流式细胞仪检测分析时选择合适的电压并调好光补偿，除实验组外建议设置阴性对照（即不加任何标记物）用于调节电压，单标对照（只加 Annexin V-APC，以及只加7-AAD的细胞）用于调节补偿；

       b. 流式细胞仪检测分析参考实例：

备注：流式细胞仪检测时Annexin V-APC可用APC通道，7-AAD选择 PerCP/Cy5.5 通道。经流式细胞仪相关分析软件绘制双色散点图, APC位于横坐标，7-AAD位于纵坐标。在典型实验中，活细胞无荧光，散点位于左下第一象限; 处于早期凋亡细胞散点位于右下第二象限; 晚期凋亡细胞、坏死细胞呈现双重荧光，散点位于右上第三象限。

2. 荧光显微镜检测

在载玻片上加5-10µL经Annexin V-APC和7-AAD双染的细胞悬液，盖上盖玻片，在荧光显微镜下用双色滤光片进行观察，Annexin V-APC 呈橙红色荧光信号，7-AAD呈粉红色荧光信号。

【用荧光显微镜拍照时建议加入适量抗荧光淬灭封片剂以防止出现荧光淬灭问题】

注意事项

1. 整个实验过程操作应尽量轻柔避免细胞破碎，影响实验结果。

2. 用 PBS 清洗细胞不可省略，同时也要尽可能的去掉残留的PBS。

3. 使用胰酶消化细胞时，应小心操作，避免人为损伤细胞，并控制消化时间。消化时间过短，细胞需用力吹打才能脱落，容易造成细胞膜的机械损伤；若消化时间过长，细胞膜同样容易受到损伤，影响检测结果。另外不能使用含EDTA的胰酶，EDTA 会影响Annexin V与PS的结合。

4. 贴壁细胞经凋亡刺激后，如有部分细胞漂浮，需同时收集细胞培养上清液及贴壁细胞合并染色，会使得结果更加准确。

5. Annexin V-APC和7-AAD对光敏感，操作时注意避光。染色反应结束后应尽快进行检测。

6. 实验过程中请穿实验服并戴一次性手套，避免污染，确保安全。