产品组成：

产品简介：

一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(One Step TUNEL Apoptosis Assay Kit)为您提供了一种高灵敏度又快速简便的细胞凋亡检测方法。对于经过固定和洗涤的细胞或组织，只要经过一步染色反应，洗涤后就可以通过荧光显微镜或流式细胞仪检测到呈现绿色荧光的凋亡细胞。
   细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以发现180-200bp的DNA ladder。基因组DNA断裂时，暴露的3'-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT)的催化下加上绿色荧光探针Cy3(Cyanine 3)标记的dUTP，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测，这就是TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法检测细胞凋亡的原理。
   本试剂盒有如下优点。(1)高灵敏度：背景染色极低，阳性染色明亮，可以在单细胞水平检测到细胞凋亡，同时由于凋亡早期就有DNA断裂，可以检测到早期的细胞凋亡。(2)特异性：TUNEL检测时通常更容易标记凋亡细胞，而不容易标记坏死细胞。(3)快速：仅需约1-2h即可完成。(4)方便：只需一步染色反应，洗涤后即可观察，不必使用二抗等进行多步操作。(5)应用范围广：可以用于检测冷冻或石蜡切片中的细胞凋亡情况，也可以检测培养的贴壁细胞或悬浮细胞的凋亡情况。(6)实测效果好本。

使用说明：
1.对于贴壁细胞或细胞涂片：
a.PBS或HBSS洗涤一次。
b.如果细胞贴得不牢，可以干燥样品使细胞贴得更牢。
c.用免疫染色固定液或4%多聚甲醛固定细胞30min。
d.用PBS或HBSS洗涤一次。
e.加入免疫染色强力通透液或含0.3% Triton X-100的PBS，室温孵育5min。
f.转步骤5。
2. 对于悬浮细胞或细胞悬液：
a. 收集细胞(不超过200万细胞)，PBS或HBSS洗涤一次。
b. 用免疫染色固定液或4%多聚甲醛固定细胞30min。为防止细胞聚集成团，宜在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动的同时进行固定。
c. 用PBS或HBSS洗涤一次。
d. 用免疫染色强力通透液或含0.3% Triton X-100的PBS重悬细胞，室温孵育5min。
e. 转步骤5。
3. 对于石蜡切片：
a. 二甲苯中脱蜡5-10min。换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5-10min。无水乙醇5min,90%乙醇2min,70%乙醇2min,蒸馏水2min。
b. 滴加20μg/ml不含DNase的蛋白酶K，免疫染色洗涤液或10mM Tris-HCl pH 7.4-7.8稀释1000倍即为20μg/ml不含DNase的蛋白酶K，20-37℃作用15-30min(不同组织的最佳作用温度和时间需自行摸索)。
c. PBS或HBSS洗涤3次。注意：这一步必须把蛋白酶K洗涤干净，否则会严重干扰后续的标记反应。
d. 转步骤5。
4. 对于冰冻切片：
a. 用免疫染色固定液或4%多聚甲醛固定细胞30-60min。
b. PBS或HBSS洗涤2次，每次10min。
c. 加入含免疫染色强力通透液或含0.5% Triton X-100的PBS，室温孵育5min。
d. 转步骤5。
5. 配制TUNEL检测液：
参考下表配制适当量的TUNEL检测液，需充分混匀。注意：配制好的TUNEL检测液必须一次使用完毕，不能冻存。

6. 对于贴壁细胞、细胞涂片或组织切片：
a. 用PBS或HBSS洗涤2次。
b. 在样品上加50μl TUNEL检测液，37℃避光孵育60min。注意：50μl TUNEL检测液适合涂片、切片或96孔板、48孔板、24孔板或12孔板的一个孔，如果是6孔板中的一个孔TUNEL检测液宜使用100μl。如果待检测的样品为涂片、切片或在24孔板、12孔板或6孔板中，可以使用防蒸发膜，或自行尝试使用自封袋或者其它适当材料自行裁剪成比孔略小的圆形塑料片，滴加TUNEL检测液后覆盖在样品上，可以防止TUNEL检测液蒸发，并且使TUNEL检测液均匀覆盖样品。自行裁剪圆片时需要连着圆片突出一个角或连着一条，并将圆形之外的突出部分折叠，方便染色结束后利用突出部分顺利取出圆片。也可以用PAP Pen圈出一个区域进行染色。孵育时需注意在多余的孔和多孔板的空隙中加入适量水以保持湿润，从而尽量减少TUNEL检测液的蒸发
c. PBS或HBSS洗涤3次。
d. 用抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观察。可以使用的激发波长范围为450-500nm，发射波长范围为515-565nm(绿色荧光)。染色效果可参见图1。
7. 对于悬浮细胞或细胞悬液：
a. 用PBS或HBSS洗涤2次。
b. 加入50μl TUNEL检测液，37℃避光孵育60min。
c. PBS或HBSS洗涤2次。
d. 用250-500μl PBS或HBSS悬浮。
e. 此时可以用流式细胞仪进行检测或涂片后在荧光显微镜下观察。可以使用的激发波长范围为450-500nm，发射波长范围为515-565nm(绿色荧光)。

注意事项：

1.微量试剂取用前请离心集液。

2.Annexin V-FITC， Propidium Iodide（PI）避光保存及使用。

3.Propidium Iodide（PI）有毒，操作时请戴手套。

4.本试剂盒适用于检测活细胞，流式细胞仪检测时，细胞数量不应低于1×10⁵，不推荐用于检测组织样本。

5.推荐使用悬浮培养细胞。如果是贴壁细胞，需用不含EDTA的胰酶消化，如消化不当，可能引起假阳性，而用细胞刮刀会造成细胞粘连成团，而影响检测。可将胰酶消化后细胞的保存在含2% BSA的PBS中，防止进一步的损伤。

6.细胞固定后可能导致荧光的淬灭，请不要固定样品。

7.因检测细胞的类型、凋亡诱导剂种类、使用的检测仪器不同，因而流式检测的荧光补偿也不同，因此建议每次检测均需使用经凋亡诱导处理的细胞作为对照，进行荧光补偿的调节。

结果示例：